【BioSpherix間歇性高低氧培養箱】
“我們”服務于睡眠呼吸暫停綜合征研究
睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS），是指睡眠時，由于上呼吸道的狹窄或者塌陷造成的睡眠時呼吸低通氣或者呼吸停頓，長期患病者可以導致高血壓、冠心病、糖尿病等一系列的綜合癥。它分為阻塞型、中樞型和混合型三大類，以阻塞性最多見。
近期北京市的調查中發現鼾癥的患病率為 13.4%。其中隨著年齡增加，患病率不斷上升，61-70 歲的鼾癥患病率達到 23.6%。而睡眠呼吸暫停的患病率為 3.1%。美國有學者認為 60 歲以上鼾癥的患病率為 50%，美國成人男性睡眠呼吸暫停發病率為 9%，女性 4%。想想我們身邊的人，五個人中可能就有一個OSA的患者。
睡眠呼吸暫停綜合征的危害是多方面的，對人體的影響也是系統性的：包括心血管系統中高血壓、心律失常等；內分泌中胰島素抵抗、糖代謝異常等；誘發呼吸衰竭、加重哮喘，還可引起難治性的慢性咳嗽、肺動脈高壓、肺栓塞，甚至肺間質疾病等。病人表現為注意力下降、認知功能下降，出現焦慮、抑郁等情緒癥狀。
人們對OSAS慢性間歇性缺氧的探索從未中斷，下面我們一起來看兩篇針對此方向的深入研究。
案例一
Delayed Neutrophil Apoptosis in Patients with Sleep Apnea
期刊：American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine(IF=21.405)
摘要：以間歇性缺氧/復氧（IHR）為特征的阻塞性睡眠呼吸暫停（OSAS）與動脈粥樣硬化相關。中性粒細胞（PMN）通過在PMN與內皮細胞的相互作用中產生氧化自由基和蛋白水解酶參與動脈粥樣硬化的形成。一般來說，缺氧促進細胞凋亡。然而，與其他細胞不同，在中性粒細胞中，缺氧嚴重抑制細胞凋亡。
方法：采用流式細胞術檢測全血中性粒細胞凋亡和粘附分子的表達，并通過各種培養條件和形態學進行驗證。同時，將全血和純化的中性粒細胞暴露于IHR和體外持續缺氧中。
將全血或純化的中性粒細胞暴露于三到六個周期的間歇性缺氧中。空氣相設定值包括35分鐘的缺氧期，然后25分鐘的復氧（21%O2和5%CO2），使用BioSpherix Oxycler C42系統（BioSpherix，Redfield，NY）。在每個1小時的周期中，實際血氧飽和度分別保持在2%或6%，持續時間為6.6, 6 ,3.6分鐘或6.55, 6, 2.75分鐘。持續缺氧（SH）的持續時間相同（血液中實際含氧量的2%）。對照組治療后的血液在常氧條件下維持相同的時間。浸入血液中的氧電極連續監測溶解氧濃度。
圖1.與常氧相比，間歇性缺氧/復氧（IHR）和持續缺氧（SH）對健康受試者多形核白細胞（PMN）凋亡測量的體外影響。（A） 流式細胞術檢測全血中性粒細胞中粘附分子CD16的低表達。（B） 經熒光DNA結合染料Hoechst 33342染色的純化中性粒細胞的細胞自旋制備的代表性顯微照片，顯示染色質凝聚和凋亡小體的明亮熒光。與常氧相比，SH中的熒光較低，IHR處理的PMN中的熒光最低。（C） 經May Grunwald Giemsa染色的純化中性粒細胞的細胞自旋制備的典型顯微照片。凋亡的中性粒細胞通過密集的染色質凝聚來鑒定，要么是單個核，要么是核碎片。細胞凋亡在常氧狀態下最高，在IHR狀態下較低。在IHR治療中，將血樣（A）或純化的中性粒細胞（B、C）暴露于六個周期。每個周期持續一小時。在缺氧期間，實際血液O2濃度為2%，持續時間為6.6-3.6分鐘。在常氧期間，血液O2在14.0 6 1.5分鐘內恢復到15%以上。在SH治療中，整個期間實際血液或介質O2濃度保持在2%。對照組在常氧條件下（21%O2，5%CO2與N2平衡）維持相同的時間。在所有處理中，二氧化碳保持不變（5%）。
圖2.睡眠呼吸暫停中白細胞在內皮細胞損傷中的作用示意圖。在常氧條件下，白細胞在血流中自由流動，內皮細胞處于非激活狀態。然而，粘附分子的基本水平在白細胞和內皮細胞表面以低水平表達。
主要結論：本研究首次證明，在中重度OSAS患者中，PMN凋亡延遲。凋亡的中性粒細胞百分比與OSAS嚴重程度呈負相關；OSAS中性粒細胞凋亡減少，粘附分子表達增加。雖然粘附分子可能促進PMN與內皮細胞相互作用的增加，但凋亡的減少可能進一步增強這些相互作用，促進自由基和蛋白水解酶的釋放；OSAS患者中性粒細胞凋亡減少，粘附分子表達增加。白細胞與延遲的中性粒細胞凋亡共同對OSAS患者的內皮細胞構成動脈粥樣硬化威脅，可通過鼻持續氣道正壓通氣有效治療。
案例二
bnormal lipid droplets accumulation induced cognitive deficits in obstructive sleep apnea syndrome mice via JNK/SREBP/ACC pathway but not through PDP1/PDC pathway.
期刊：Molecular Medicine
摘要：慢性間歇性低氧(CIH)導致認知障礙的機制尚不清楚。但在這里，我們的研究發現，約3個月的CIH治療誘導C57BL/6小鼠海馬神經和膠質細胞中的脂滴(LDs)積聚，并引起嚴重的神經損傷，包括神經元損傷、成神經細胞(NB)凋亡和異常的膠質細胞活化。也就是說OSAS造成的CIH，可引起嚴重的神經認知功能障礙，與海馬形態學的區域性改變有關；脂質代謝紊亂導致神經和神經膠質細胞損傷，最終導致行為功能障礙。
方法：SMND-309提取自丹參。給藥后可在大鼠腦中檢測到其為丹酚酸B的新代謝產物.研究證明309通過抗凋亡、抗炎和抗氧化作用促進神經元存活。在這項研究中，SMND-309被腹膜內注射到小鼠體內，以減輕CIH引起的神經損傷。這可能有助于開發潛在的治療OSAS的藥物靶點。
CIH：
小鼠每天從上午8:00到下午4:00暴露在CIH/室內空氣(RA)條件下，持續約3個月。在暴露期間，將WT + CIH組和SMND-309 + CIH (3-FP + CIH)組中的小鼠放入CIH室(BioSpherix OxyClycler A84，美國)，將WT + r A組和SMND-309 (3-FP)組放入RA室(BioSpherix OxyClycler A84，美國)。首先，這個小室充滿了氮氣持續85-95秒，氧氣水平從21%±1%(正常)降至7%±1%(缺氧)。然后，氧氣水平在15-20秒內保持在7%±1%。最后，氧氣水平在45-50秒內恢復到21%±1 %,并持續15-20秒。CIH循環持續約180秒，每小時約20個循環。RA艙內的氧氣水平始終保持在21%±1%。
IH：
通過在安裝在培養箱內的氧氣控制柜(Biospherix Oxycycler C42)中培養細胞來誘導IH，該氧氣控制柜配備有用于連續監測氧氣水平的氧氣傳感器。氮氧和5%二氧化碳的混合物輸注，氧水平包括30分鐘的低氧期(3% O2)，隨后是30分鐘的復氧期(21% O2).實際O2在每個1小時的循環中，飽和度保持在3% 10分鐘，進行3天。
圖3.SMND-309的研究過程和結構。A.研究工作流程。在7天的適應后，小鼠暴露于CIH條件下約3個月，并在最后一周用SMND-309治療。CIH暴露結束后，立即進行行為測試。B.CIH治療計劃。紅線代表設定點。藍線代表實際的含氧量。C.SMND-309的結構
圖4.DG區的病理變化。A.海馬的H&E染色。在WT + CIH組的SGZ中，幾乎沒有觀察到NBs(白色箭頭)，但是SMND-309治療減輕了損傷。原始放大倍數:400倍。B.海馬的透射電鏡結果。WT + CIH組的神經元表現出細胞質空泡化、LDs積聚(黑色箭頭)和線粒體破裂(黑色三角形)。此外，WT + CIH組的神經膠質細胞出現水腫(黑星)，尤其是在血腦屏障周圍區域。原始放大倍數:15000倍。所有實驗重復三次。
主要結論：SMND-309是丹參，已應用于神經保護，SMND-309治療通過減少DG區神經和神經膠質細胞中LDs的積累來改善CIH小鼠的行為表現。這些發現可能有助于提供一種新的潛在的神經保護療法。在這項研究中，CIH誘導的海馬損傷是由NBs、神經元和神經膠質細胞中LDs的積累觸發的。LDs的產生可通過JNK/SREBP/ACC途徑調節。SMND-309治療減輕了這些損傷。迄今為止，LDs在神經細胞中的作用仍有爭議。脂質合成障礙和LDs異常積聚機制仍不清楚。所有這些問題都需要進一步研究。
在對OSAS的研究中，無論是以細胞還是動物為實驗建模對象，都離不開間歇性缺氧這個實驗條件，在兩份研究中，能精準控制中性粒細胞和小鼠缺氧暴露時間與濃度的設備，都是來自Biospherix的產品：
01 OxyCycler C42高級動態可編程氧氣控制系統
動態雙通道/雙氣體控制器。可同時連接兩個C-chamber,各自獨立編程。
動態氧氣編程，氧氣設置0.1-99.9%，二氧化碳設置0.1-20.0%
外接CO2、N2和O2三個氣瓶，輕松實現急性高氧/缺氧、慢性缺氧和高/低氧交替控制
可同時獨立編程控制兩個腔室的氣體濃度曲線
通過電腦軟件，可預編程和存儲不同的氣體濃度升降位點、持續時間以及循環次數，實時記錄和存儲氣體濃度等數據。
02 OxyCycler A840V動態編程氧氣控制系統
可動態設定氧氣濃度（0.1-99.9%），可同時控制4個動物籠,，獨立運行不同的程序
可以輕松完成程序式低氧/高氧控制
可快速達到氧氣濃度設定值，并循環程序1-999次或無限
可選配監控器，快速檢測到氣體濃度中斷并及時修正
電腦操作界面，實時記錄探頭反饋數據，顯示趨勢圖表
參考文獻：
【1】Dyugovskaya L, Polyakov A, Lavie P, Lavie L. Delayed neutrophil apoptosis in patients with sleep apnea. Am J Respir Crit Care Med. 2008 Mar 1;177(5):544-54. doi: 10.1164/rccm.200705-675OC. Epub 2007 Nov 15. PMID: 18006889.
【2】Li, D., Xu, N., Hou, Y. et al. Abnormal lipid droplets accumulation induced cognitive deficits in obstructive sleep apnea syndrome mice via JNK/SREBP/ACC pathway but not through PDP1/PDC pathway. Mol Med 28, 3 (2022). https://doi.org/10.1186/s10020-021-00427-8
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